Modelación de la etapa de recuperación intermedia de DNA plasmídico mediante ultrafiltración de flujo tangencial

Abstract

La necesidad de obtener un proceso de producción de plásmido de la más alta calidad, para ser utilizado en terapia génica y vacunación, ha llevado a la realización de estudios detallados de cada una de las etapas de este proceso. En el presente trabajo se estudia la etapa de recuperación intermedia, la cual es llevada a cabo por la operación de Ultrafiltración de Flujo Tangencial. Esta es una operación escalable y sencilla de realizar que cuenta con la ventaja de no utilizar solventes químicos ni enzimáticos de origen animal. Su principio en separación está basado en la diferencia de tamaños, lo que garantiza la separación de las moléculas de plásmido DNA de algunos de los contaminantes presentes como el RNA, las cuales son partículas más pequeñas y logran atravesar la membrana de filtración. Para la realización de los estudios se estableció un sistema experimental de ultrafiltración con una membrana de 300 kDa, la cual es recomendada para la separación de plásmidos de hasta 15 kbp. Con este sistema se filtraron muestras de lisados clarificados de concentración conocida, para la obtención de parámetros de operación indispensables en el escalamiento del proceso. De igual manera se determinaron los parámetros óptimos para diafiltración, la cual es una operación de suma importancia en el proceso de obtención del plásmido, ya que nos permite realizar el intercambio de buffer para garantizar la correcta operación de las etapas de alta resolución. Finalmente por medio de un análisis cualitativo y cuantitativo de muestras filtradas y retenidas, se corroboro la presencia del plásmido en el sistema, así como se descartó el traspaso de estas macromoléculas a través de la membrana.