Sobreexpresión, purificación y modelado tridimensional de triosafosfato isomerasa recombinante de Tribolium castaneum

Abstract

A nivel mundial las pérdidas de producción de cereales como el trigo, son una problemática que representan un grave impacto económico. Las principales causas de éstas pérdidas se deben principalmente a deficientes prácticas de cosechado y almacenamiento, las cuales promueven la proliferación de plagas como lo es Tribolium castaneum. El estudio estructural de enzimas que participan en la glucólisis, como la Triosafosfato isomerasa (TIM), puede ayudar a implementar nuevas estrategias para diseñar inhibidores de control de plagas. De tal manera que el objetivo general del presente trabajo consistió en la sobreexpresión y purificación de la triosafosfato isomerasa recombinante de Tribolium castaneum, lo que permitirá realizar una futura caracterización enzimática. La metodología consistió en sobreexpresar la proteína recombinante mediante un sistema de expresión bacteriano, para lo cual previamente se realizó la introducción del plásmido pJ414 de DNA 2.0 ®, con la secuencia génica que codifica a la enzima, en la cepa bacteriana de E. coli BL21 Gold. Los factores que se tuvieron en cuenta fueron: el medio de crecimiento, el número de bacterias antes de inducir la sobreexpresión, la concentración del inductor y tiempo de inducción. La enzima se logró purificar mediante una cromatografía de afinidad de metales quelantes inmovilizados según lo reveló el análisis por electroforésis SDS-PAGE y su actividad enzimática específica fue determinada mediante un mecanismo de acción acoplado utilizando como enzima acoplada la α-glicerofosfato deshidrogenasa. Por otra parte se realizaron pruebas preliminares de calorimetría de titulación isotérmica para determinar los parámetros cinéticos de la enzima en donde se observó un alto calor de dilución por lo que es necesario rediseñar el experimento para su optimización. Finalmente se realizó un modelado tridimensional in silico en base a la estructura experimental de la triosafosfato isomerasa de Tenebrio molitor obteniendo una estructura confiable debido al alto grado de identidad que presenta con respecto a T. castaneum. Los resultados obtenidos pueden ser una herramienta útil para posteriormente llevar a cabo una caracterización enzimática completa que ayude a conocer los detalles del mecanismo catalítico de la triosafosfato isomerasa de Tribolium castaneum. Esto puede proporcionar información referente a la capacidad de adaptación que poseen las plagas con la que en un futuro se podrían desarrollar nuevos métodos específicos de control de plagas que no generen resistencia y promuevan el desarrollo sustentable en la producción de cereales.