Sobreexpresión recombinante de mutantes de tripsina III de sardina Monterrey (Sardinops sagax caerulea)

Abstract

Sardina Monterey (Sardinops sagax caerulea) es el principal producto pesquero en México, donde la mayor parte se destina para la elaboración de productos que generan residuos. Las vísceras son un subproducto aprovechado para la obtención de enzimas proteolíticas como tripsina. La obtención de tripsinas de peces es de importancia científica en el estudio de la relación estructura y función en la adaptación al frío, ya que se ha demostrado que presentan mayor actividad catalítica a temperaturas bajas que su contraparte mesófila. Con la finalidad de comprender la función de ciertos aminoácidos sobre la adaptación al frío, este trabajo tiene como objetivo evaluar distintas condiciones de sobreexpresión para obtener mayor rendimiento de las mutantes de tripsina III de sardina Monterey de forma recombinante en Escherichia coli. Este estudio servirá para que futuros trabajos se adentren en la relación entre estructura y función en mutantes de tripsina III. Se utilizaron las cepas de E. coli BL21 (DE3) Gold y BL21 DE3) Origami, las cuales se transformaron con un vector pET-32a que codifica para la tripsina III de sardina Monterey en sus formas mutantes A233N y L234Y, además produce una proteína de fusión a tiorredoxina. La sobreexpresión de proteína se analizó mediante SDS-PAGE, actividad enzimática frente al sustrato BApNA y cuantificación de proteína. Las mutantes de tripsina III se obtuvieron exitosamente de forma recombinante en las cepas utilizadas. Al analizar la producción de proteína se determinó que la cepa de E. coli Gold obtuvo un mejor rendimiento de fracción soluble en comparación al fracción insoluble, y mayor actividad enzimática que la cepa Origami. Además, al inducir la expresión de proteína con IPTG a una concentración de 0.5 mM a 16 °C como temperatura de incubación, se obtuvo un mejor rendimiento en comparación a las temperaturas de 25 °C y 20 °C.