Estandarización y validación de una técnica electroforésica para la detección de actividad lipásica

Abstract

Las lipasas son enzimas cuya denominación bioquímica es acil-éster-hidrolasas, con actividad catalítica específica para llevar acabo reacciones de hidrólisis, esterificación e interesterificación. Las lipasas actualmente están siendo muy estudiadas ya que constituyen un importante grupo de biocatalizadores con amplio potencial biotecnológico y pueden ser de origen bacteriano, fúngico, vegetal y animal. La electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) es un método específico, sensible y eficaz, que es ampliamente utilizado para la caracterización de proteínas purificadas. En el presente trabajo se estableció un método de PAGE-Nativa para la separación de lipasas y detección de su actividad lipásica por medio de zimografía. Primeramente, se estandarizó la técnica de referencia para la separación de tres lipasas solubles comerciales A-12 de Aspergillus niger, AY-30 de Candida rugosa y F-AP15 de Rhizopusoryzae. Se encontró que estas enzimas no son totalmente puras y se requiere de un método específico para la identificación de la banda de lipasa. Cuando se utilizó como sustrato de revelado al butirato de 4-Metilumbeliferilo(4-MUFB) se logró visualizar las bandas con actividad lipásica al hacer incidir la luz UV a 254 nm. Utilizando un análisis por densitocolorimetría se estableció el rango dinámico lineal (R2>0.99) para la cuantificación de la actividad lipásica. Además, se establecieron los límites de detección y cuantificación respectivos, así como el coeficiente de variación y precisión al momento de replicar los análisis. Los resultados de este trabajo demuestran que es factible utilizar el método de zimografía establecido para el análisis de muestras de investigación o diagnóstico clínico donde se requiera analizar la actividad lipásica.