Escalamiento de columnas de cromatografía de membranas de intercambio iónico para la purificación de ADN plasmídico

Abstract

Tesis de maestría en ciencias de la ingeniería. En esta investigación se desarrolló y evaluó un nuevo bioproceso para la propagación, recuperación y purificación de ADN plasmídico. A nivel laboratorio, se llevó a cabo la propagación del plásmido pcDNA-Ehcp112 por medio de replicación autónoma en células de E. coli de la cepa DH5α en una fermentación por lote. La recuperación primaria comprendió las etapas de cosecha celular, lisis alcalina, neutralización y filtración. En la lisis alcalina y neutralización se utilizó agitación moderada por 5 minutos para provocar la formación de flóculos bien definidos que facilitaran la clarificación del lisado celular. En la recuperación intermedia, la solución conteniendo al plásmido fue lavada por diafiltración, requiriendo un promedio de 10 volúmenes, y fue posteriormente concentrada. La purificación final se llevó a cabo en columnas de cromatografía empacadas con membranas de intercambio iónico, utilizando un gradiente que permitió la elución diferenciada de los ácidos nucleícos presentes en el lisado, separando claramente al ARN del ADNp, de acuerdo al análisis realizado por electroforesis en gel de agarosa al 0.8%. Se realizaron varios estudios de escalamiento utilizando simulación con el software SuperPro Designer v.7.0, y se utilizó como base de comparación el Proceso I reportado en la literatura. Se escaló el bioproceso desarrollado en el laboratorio, Proceso II, demostrándose su factibilidad técnico-económica. Se realizó la validación del Proceso I cambiando a fermentación continua en la simulación, logrando obtener los resultados reportados, Proceso III. El Proceso IV fue desarrollado basado en los resultados del laboratorio y en reportes de la literatura, agregando varias modificaciones al proceso original. El análisis económico de este bioproceso, presentó muy buenos resultados de rendimiento, así como de factibilidad económica.