Estudio comparativo de la purificación de DNA plasmídico por cromatrografía de intercambio iónico en membranas y en partículas perfusivas

Abstract

En la actualidad la demanda de DNA plasmídico (pDNA) de alta pureza se ha incrementado en respuesta a los rápidos avances en su uso en terapias génicas y vacunas; éstas se basan en el mismo principio: la introducción de genes en células receptoras para restaurar, cancelar, mejorar o introducir una función bioquímica. El desarrollo de una operación unitaria eficiente y rentable de captura de las moléculas de pDNA de grandes volúmenes de lisado representan un gran reto. Existen varios protocolos y kits comerciales en escala de laboratorio, sin embargo, estos no son adecuados para la purificación de pDNA terapéutico en gran escala, debido a la utilización de materiales tóxicos y / o dificultades en el proceso de escalamiento. Un bioproceso típico consta de cuatro etapas: propagación celular, recuperación primaria, recuperación intermedia y purificación final. Esta última es crucial para obtener un producto de alta pureza libre de contaminantes. La cromatografía es la única operación unitaria aceptable para la captura y purificación del plásmido. De los tipos de cromatografía que existen, el intercambio iónico resulta favorable para la captura del DNA debido a su estructura química. Previo a la purificación final por cromatografía de intercambio iónico, es pertinente realizar estudios de pre-purificación de un lisado para recuperar y concentrar el pDNA, así que fue necesario describir el comportamiento de la ultrafiltración de flujo tangencial (TFF) en la recuperación intermedia del plásmido pVAX1-NH36 a partir de lisados de cultivos de E.coli. El principio de separación que se basa en la diferencia de tamaños, garantiza el paso de las moléculas de RNA, proteínas, endotoxinas, sales y otros contaminantes presentes en el lisado, a través de la membrana y reteniendo el pDNA. En esta investigación se utilizó una membrana de fibra hueca con tamaño de poro de 300 kDa. El objetivo de esta investigación fue describir y analizar el comportamiento de la pre-purificación de pVAX1-NH36 por ultrafiltración de flujo tangencial en modo batch; así como describir, analizar y comparar la purificación por cromatografía de intercambio iónico en columnas empacadas con membranas y con partículas perfusivas como fase estacionaria, utilizando gradientes salinos. Se utilizaron membranas Mustang Q con poros de 800 nm y partículas superporosas perfusivas POROS 50 HQ poros perfusivos de 600-800 nm y poros difusivos de 80-150 nm para determinar cuál promete más ventaja. Se alimentaron a las columnas en modo frontal lisados pre-purificados mediante ultrafiltración tangencial. Las columnas fueron eluídas mediante un gradiente salino que permitió obtener una fracción de pDNA purificado en cada caso, de acuerdo a los resultados de los análisis de electroforesis en gel de agarosa y Cromatografía Líquida de Interacción Hidrofóbica de Alta Resolución (HPLC-HIC).