Respuesta de estrés de hongos fitopatógenos expuestos a biocompositos de quitosano-carragenina-lisozima con aplicación potencial en productos hortofrutícolas

Abstract

A partir de estudios donde se ha realizado la inmovilización de enzimas antimicrobianas como la lisozima en matrices poliméricas, se ha observado un aumento en la actividad antibacteriana y efectividad (Gálvez-Iriqui, Plascencia-Jatomea and Bautista-Baños, 2020). El quitosano y la carragenina son matrices poliméricas que se han utilizado para este fin. En este capítulo se muestran los resultados más relevantes de la evaluación de la actividad biológica de biocompuestos de quitosano-carragenina-lisozima (CS-CRG-k/LZ). A partir de la caracterización parcial de las materias primas se obtuvo un peso molecular viscosimétrico (Mv) de 105.8 kDa y porcentaje de grado de desacetilación de 67.6 ± 2.9 %, los cuales son valores bajos para un quitosano reportado como de medio peso molecular. Respecto a la caracterización de lisozima, se evidenció que esta presenta actividad en un amplio rango de pH desde 3 a 7, sin embargo, el mayor porcentaje de actividad enzimática relativa se encuentra entre 5.5 a 6.5 (pH óptimo). Asimismo, la actividad enzimática se mantuvo estable por encima del 85 % a pH 6 y 7 por 120 horas. La -carragenina utilizada en el estudio, según el proveedor, tiene las siguientes especificaciones: contenido de grupos sulfatos (28 %), metales pesados (0.002 %), cenizas (2 ppm) e insolubles en ácido (0.6 %). El material CS--CRG-Lz fue sintetizado utilizando la técnica de complejación iónica, la cual permitió obtener un material de 332.94 nm ± 5.6 nm de diámetro hidrodinámico, + 26 mV ± 1.1 mV de potencial Z y 0.243 ± 0.0 de índice de polidispersión. El material de CS--CRG-Lz presentó un porcentaje de eficiencia de encapsulación de 63.14 ± 1.24 % y un porcentaje de capacidad de carga de 28.54 ± 4 %. El análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM) realizado en la muestra sólida, indicó la presencia de partículas aglomeradas debido al proceso de liofilización. Sin embargo, las micrografías por microscopía electrónica de barrido ambiental (MEB-A), obtenidas en muestras líquidas, sugieren que las partículas son esféricas y ovaladas con una distribución de tamaños mayormente homogénea. El ensayo de fitotoxicidad con semillas de lechuga demostró que los biomateriales de CS--CRG-Lz a partir de 268 g/ ml inhiben en un 93 % la germinación de la semilla y, por tanto, la elongación de las radículas y del hipocótilo. Los índices normalizados de la elongación de las radículas (REI) y el índice de germinación (NGI) evidenciaron que los materiales inducen una toxicidad de alta a moderada, lo que pone en evidencia que estos no son materiales aptos para dar tratamiento a la semilla. Para la evaluación antifúngica del material CS--CRG-Lz, se realizó un aislamiento y la identificación de un cultivo puro de un hongo fitopatógeno procedente de tomates contaminados, esto indicó a partir de la evaluación de sus características macroscópicas, microscópicas y un análisis molecular que se trataba de Fusarium verticillioides; sin embargo, al ser este un hongo saprófito y no considerarse un fitopatógeno propio de los cultivos de tomate, se siguió la recomendación de evaluar los nanomateriales de CS--CRG-Lz con otras cepas fitopatógenas de interés. La evaluación de la actividad antifúngica de la lisozima pura sobre F. verticillioides indicó que esta es capaz de provocar un efecto fungistático sobre sobre el crecimiento macroscópico (crecimiento radial) y microscópico (germinación de esporas) de F. verticillioides. El efecto de la lisozima a nivel estructural, a partir de tinciones de fluorescencia, indicó que esta es capaz de alterar el desarrollo de hifas durante el proceso de germinación. Este comportamiento es de interés, ya que evidencia que la lisozima puede tener propiedades antifúngicas y es posible que al inmovilizarla en un nanomaterial a base de quitosano y carragenina aumente su actividad. Derivado de la evaluación del efecto antifúngico de los nanomateriales de CS--CRG-Lz, los resultados del ensayo colorimétrico de viabilidad de esporas de F. verticillioides, indicaron que esta cepa es altamente sensible al material, ya que fue inhibida completamente (100 % de inhibición) a todas las concentraciones evaluadas (50 g/mL a 1 mg/mL). Asimismo, se evaluó el efecto del nanomaterial sobre el crecimiento radial de cuatro cepas fitopatógenas para productos hortofrutícolas Aspergillus flavus, Rhizopus stolonifer, Alternaria alternata y Penicillium crostosum aisladas e identificadas previamente en el Centro de Desarrollo de Productos Bióticos (CEPROBI-IPN). En el caso particular de A. alternata, esta experimentó una inhibición de su crecimiento radial en un 100 % cuando fue expuesta a 350 g/ml del nanomaterial de CS-- CRG-Lz, seguido de P. crostosum con un 14.6 % de inhibición, R. stolonifer con un 14 % de inhibición y A. flavus con un 7 % de inhibición del crecimiento radial. Los parámetros cinéticos estimados con el modelo de Gompertz para el crecimiento máximo confirmaron la sensibilidad de A. alternata con la velocidad de crecimiento, la fase lag y el crecimiento máximo. La exploración a campo claro de las estructuras del micelio formado de R. stolonifer evidenció afectaciones en el desarrollo de las higas durante la etapa de crecimiento apical después de la exposición a los nanomateriales de CS--CRG-Lz.