Producción y encapsulamiento de PVAX1-NH36 para su uso en vacuna contra leishmaniasis

Abstract

El uso de ADN plasmídico (ADNp) es un nuevo enfoque para formular vacunas humanas contra la leishmaniasis, una enfermedad tropical desatendida con manifestaciones clínicas severas. El desarrollo de bioprocesos factibles para obtener tales vacunas es una prioridad de salud pública. El objetivo de este trabajo fue establecer un esquema de producción y de encapsulación de pVAX-NH36, para su uso como vacuna contra leishmaniasis y evaluar su eficiencia transfectiva e inmunológica. Para lograr un sistema robusto y optimizado de producción del pVAX-NH36 se procedió a estandarizar el inóculo, comparar el sistema perfusivo con alimentación exponencial (PAE) con los sistemas convencionales de lote y lote alimentado; y a optimizar a nivel biorreactor el sistema PAE. Se estandarizó la preparación del inoculo creando un banco celular de Escherichia coli DH5α proveniente de un cultivo en placa. Las condiciones óptimas para la obtención del inoculo fueron cultivar a 37 °C durante 8-10 h a 350 rpm. En la comparación de los sistemas de fermentación la densidad óptica máxima obtenida en cada experimento fue de 12.0 en lote, 30.0 en lote alimentado y 41.0 DO600 en el sistema PAE; y el rendimiento máximo de plásmido alcanzado fue de 2.02 mg/(L-OD600), 3.22 mg/(L-OD600) en lote y 3.67 mg/(mL-OD600), respectivamente. Los resultados experimentales de producción de biomasa y consumo de sustrato se ajustaron a modelos matemáticos y presentaron un buen ajuste con una r2=0.99, en ambos casos. Para demostrar la flexibilidad del sistema PAE se utilizaron glucosa y glicerol como fuente de carbono. Se midieron las cinéticas de biomasa, sustrato y plásmido. Los modelos matemáticos empleados se ajustaron a los datos experimentales y se usaron para describir el comportamiento del sistema (r2> 0.95). Se obtuvieron productividades de plásmidos de 13.3 mg/(L-h) con glucosa y 19.4 mg/(L-h) con glicerol. Estos niveles representan un aumento de 1 a 3 veces en productividad en comparación con cultivos reportados anteriormente utilizando E. coli DH5α. Se prepararon nanovacunas mediante la encapsulación del plásmido en nanopartículas lipídicas catiónicas, obteniéndose partículas de diámetro aproximado a 120 nm con una potencial zeta (PZ) de alrededor de 17 mV y un índice de polidispersidad (IPD) de 0.14, lo cual se encuentra en el rango recomendado para su uso. La nanovacuna presentó un mayor porcentaje de transfección (97%) que el plásmido desnudo (78%), y no mostro citotoxicidad significativa. Las células RAW 264.7 mostraron producción de TNF- pero no de IL-6, en respuesta a la nanovacuna, lo que sugiere un perfil de citocinas adecuado para la inducción de una respuesta inmune celular, lo cual es favorable en el tratamiento contra leishmaniasis. La investigación realizada proporciona el conocimiento fundamental para el diseño a escala de un bioproceso para la producción de vacunas de tercera generación, y sirve para promover la realización de los estudios clínicos correspondientes y la eventual transferencia de esta tecnología.