Determinación de condiciones experimentales para la generación de cristales de tripsina de sardina Monterey (Sardinops sagax caerulea)

Abstract

La tripsina es la serina proteasa más estudiada debido a sus múltiples aplicaciones biotecnológicas, en el caso de tripsina I de sardina Monterey (Sardinops sagax caerulea), muestra características cinéticas y termodinámicas que la definen como una enzima adaptada al frío, estas características están íntimamente relacionadas con su estructura. Actualmente se conoce la estructura terciaria de tripsina I in silico, generada a partir de la estructura cristalográfica de salmón PDB (1HJ8), el cual presenta una identidad del 88% en su secuencia de aminoácidos con tripsina de sardina la cual brinda una idea general de la posible distribución de la proteína, pero este modelo no muestra la posición exacta de los aminoácidos en el espacio, las zonas de la proteína con mayor flexibilidad o la distancia entre los residuos en el sitio activo responsables de la catálisis. Sin embargo, conocer estas características es clave en la comprensión del proceso de adaptación al frío; de ahí surge la necesidad de obtener la estructura cristalográfica. Por lo que este trabajo tiene como objetivo determinar las condiciones necesarias para la obtención de cristales de tripsina I a partir del ciego pilórico de sardina Monterey (Sardinops sagax caerulea), con el fin de establecer el primer paso en la caracterización de su estructura por difracción de rayos X. Para alcanzar este objetivo se purificó tripsina I a partir del ciego pilórico de sardina Monterey (Sardinops sagax caerulea), haciendo uso de los métodos de cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de afinidad y cromatografía de intercambio iónico; la presencia de la proteína con un 90% de pureza se evidenció en un gel de electroforesis SDS-PAGE al 15 %, donde se observó la banda de 25 kDa característica que corresponde a tripsina I. Durante el establecimiento de las condiciones de cristalización se utilizaron los Kits comerciales de Jena Bioscience WIZARD I y II, ambos con un total de 96 condiciones de cristalización que contienen condiciones de pH, fuerza iónica, aditivos y soluciónes amortiguadoras las cuales fueron evaluadas por dos técnicas de cristalización distintas microbatch y difusión de vapor por gota colgante. Por la técnica de microbatch fue posible observar el crecimiento de sólidos cristalinos en cuatro de las condiciones y uno 1 por difusión de vapor. La composición de los cristales se identificó por medio de la tinción diferencial IZIT la cual demostró el origen salino de los cristales.