Sobreexpresión recombinante de la mutante Ser153: Gly de la hemolisina termolábil dependiente de lecitina de Vibrio parahaemolyticus

Abstract

En los últimos años la camaronicultura se ha visto afectada debido a la aparición de enfermedades infecciosas causadas por distintos patógenos marinos, lo que ha provocado pérdidas importantes a la economía de este sector agropecuario. Una de las infecciones más comunes presentes en los camarones es la vibriosis. Algunos estudios sugieren que la incidencia de mortalidades masivas de camarones de cultivo podría deberse a una enfermedad presente en los camarones conocida como el síndrome de mortalidad temprana, la cual es causada por la especie Vibrio parahaemolyticus. Esta bacteria presenta diversos factores de virulencia como la hemolisina termolábil dependiente de lecitina (LDH por sus siglas en inglés). Así mismo, se ha identificado que las cepas patógenas para camarón presentan el gen que codifica para esta hemolisina. Por otro lado, la serina en la posición 153 en la secuencia de LDH de otras especies de Vibrio, es un residuo importante durante la función de este tipo de enzimas. En base a lo anterior, la sustitución de la serina 153 de la LDH por glicina (Ser153/Gly_LDH) puede afectar total o parcialmente la función de la enzima, es decir, ya sea su actividad catalítica y/o su función hemolítica. En el presente trabajo se realizó la sobreexpresión de la hemolisina mutante Ser153/Gly_LDH recombinante de V. parahaemolyticus. La Ser153/Gly_LDH se sobreexpresó en la cepa de E.coli Rosetta utilizando 0.4 mM de IPTG como inductor por 6 h a 37 ºC. La enzima se obtuvo en forma de cuerpos de inclusión por lo que fue solubilizada en urea 8M. Se purificó por cromatografía de afinidad a metales en condiciones desnaturalizantes obteniendo una única banda correspondiente al peso molecular esperado de aproximadamente 47 kDa. Posteriormente, la Ser153/Gly_LDH purificada fue replegada por el método de diálisis eliminando completamente la urea obteniendo la enzima en la fase soluble. Se evaluó la actividad enzimática de la mutante cualitativa y cuantitativamente y se observó que perdió casi un 100 % de su actividad enzimática. Así mismo, la mutante específica de la LDH solo mostró actividad hemolítica residual (< 2 %). En base a los resultados presentados, se concluye que la Serina 153 desempeña un papel esencial durante la función de la LDH de Vibrio parahaemolyticus.