Estudio cinético sobre la lisis alcalina de Escherichia coli DH5α para la recuperación primaria del plásmido pVAX1-NH36

Abstract

La Leishmaniasis es una enfermedad, provocada por parásitos del género Leishmania y transmitida por medio de mosquitos, ésta se trata de combatir por medio de vacunas ya quesu incidencia va en aumento. El avance tecnológico en la ciencia permitió el desarrollo de mejores vacunas como las de ADN que dependen de plásmidoscon un gen insertado dentro de su estructura polinucleotídica, para codificar una proteína contra cierta enfermedad, en este caso la Leishmaniasis; el plásmido utilizado para esta vacuna es el pVAX1-NH36; éste es insertado en células de Escherichia coli y se reproduce por medio de una fermentación, recuperación primaria o lisis, una recuperación secundaria y purificación. El método de recuperación primaria más utilizado es el de lisis alcalina, para el cual es necesario establecer un protocolo de tiempo de lisis y concentración de NaOH óptimos. Se trabajó con una cinética de rompimiento celular de tres molaridades de NaOH a seis tiempos de incubación celular, que permitió encontrar las condiciones de óptima recuperación de PVAX1-NH36. Se determinó la cinética de liberación de Proteína Total (PT) en las muestras obteniendo como resultado que el tiempo y la molaridad del buffer no determinan la cantidad de PT liberada; se analizó cualitativamente la cinética de recuperación del plásmido en electroforesis en gel de agarosa, presentando en el segundo estudio experimental mayor concentración de PVAX1 NH36 en lisados trabajados con alta molaridad de NaOH. Se cuantificaron las concentraciones del plásmido por medio de HPLC con columna de interacción hidrofóbica obteniendo, en el mismo experimental, mayor concentración de PVAX1-NH36 a quince minutos de incubación con la molaridad más alta, distinto a lo publicado por algunos autores. La cinética de recuperación primaria nos indica que el mejor tiempo de incubación celular con el buffer es de quince minutos, y la mejor molaridad de NaOH para este es de 0.2.