Estandarización del cultivo de Mycobacterium tuberculosis H37Rv en medio líquido M7H9 y aislamiento de proteínas hidrofóbicas del filtrado de cultivo

Abstract

Justificación: En las últimas décadas, una parte de la investigación del proteoma de Mycobacterium tuberculosis H37Rv se ha centrado en las proteínas que éste libera al medio de cultivo en el que crece in vitro (CFP, por las siglas del término en inglés Culture Filtrate Protein). Con este enfoque se espera un avance significativo en el conocimiento de la patogénesis de la tuberculosis y el desarrollo de nuevas vacunas y métodos para el diagnóstico temprano de la enfermedad. Entre las proteínas del CFP, se encuentran proteínas hidrofóbicas relacionadas con la capacidad de invasión, proliferación y supervivencia de la bacteria dentro de las células infectadas, lo que sugiere el potencial valor del aislamiento y purificación este tipo de proteínas. Sin embargo, para estudiar estas proteínas es necesario obtener el CFP en cantidades adecuadas y luego separar a las hidrofóbicas bajo condiciones que preserven su estabilidad. Hipótesis: Mycobacterium tuberculosis H37Rv, cultivado en medio líquido M7H9 enriquecido con caseína hidrolisada, expresa proteínas hidrofóbicas en la cantidad necesaria para separarlas por cromatografía de interacciones hidrofóbicas. Objetivo: Estandarizar el cultivo de Mycobacterium tuberculosis H37Rv, en medio líquido M7H9 enriquecido con caseína hidrolisada, para el aislamiento de las proteínas hidrofóbicas del filtrado de cultivo. Materiales y Métodos: Este fue un trabajo experimental, en el que se utilizaron cultivos axénicos de M. tuberculosis H37Rv desarrollados en el medio de cultivo líquido M7H9 para obtener las proteínas del medio líquido e identificar proteínas afines a adsorbentes hidrofóbicos acilados. Para ello, se probaron dos fuentes distintas de caseína hidrolisada (Bacto-casitona y Triptosa) para enriquecer el medio M7H9, a tres porcentajes (2, 4 y 6%) y tres diferentes tiempos de incubación (4, 6 y 8 semanas). El FP fue cargado a tres adsorbentes hidrofóbicos (Sefarosa acetilada, Sefarosa butilada y Sefarosa hexilada,) y, finalmente, los aislados proteicos obtenidos con Sefarosa acetilada y Sefarosa hexilada, fueron evaluados por microcalorimetría isotérmica para estimar el tipo de interacción hidrofóbica y la constante de afinidad entre el adsorbente y las proteínas. Resultados y Conclusiones: Se establecieron las condiciones de crecimiento de Mycobacterium tuberculosis H37Rv en medio líquido M7H9 enriquecido con Triptosa y Bacto-casitona, con un rendimiento proteico en el filtrado de cultivo de 2.3 a 3.5 mg/L. Al comparar los filtrados de cultivo nativos obtenidos con Bacto-casitona y Triptosa, los perfiles electroforéticos fueron aparentemente similares, sin embargo se encontraron diferencias cualitativas y cuantitativas mediante los ensayos cromatográficos. Con ambos enriquecimientos se demostró que una proporción inesperadamente alta de proteínas del filtrado proteico micobacteriano (aproximadamente 50%) asume un comportamiento hidrofóbico bajo las condiciones cromatográficas ensayadas en este trabajo; la adsorción de las proteínas del filtrado de cultivo y los geles acilados, se basa en una interacción endotérmica entrópicamente dirigida. La fracción de elución obtenida con Sefarosa acetilada y el cultivo de 4 semanas con Triptosa al 2%, parece ser una fuente para la purificación de bandas asociadas por su masa molecular con las proteínas del complejo 85, mientras que las fracciones de elusión obtenidas en Sefarosa butilada y hexilada, a partir del mismo cultivo, podrían servir como fuente para la purificación de bandas relacionadas con proteínas de estrés térmico tales como las de 10, 23, 65 y 70 kDa (estas bandas son más intensas en los cultivos de 6 y 8 semanas) y bandas como la 38 y 45/47 kDa, asociadas con proteínas fuertemente inmunorreactivas. Finalmente, con la estandarización del cultivo de Mycobacterium tuberculosis H37Rv, la demostración de la presencia de proteínas hidrofóbicas en el filtrado de cultivo y su aislamiento con las matrices hidrofóbicas, se sientan las bases para la purificación y caracterización bioquímica e inmunoquímica de estas proteínas micobacterianas.