Inhibición de la Hemolisina Termolábil dependiente de lecitina de Vibrio parahaemolyticus mediante compuestos fenólicos

Abstract

La hemolisina termolábil dependiente de lecitina (LDH) es un factor de virulencia excretado por Vibrio parahaemolyticus (Vp). Esta enzima tiene actividad de fosfolipasa A2/lisofosfolipasa. La LDH cataliza la hidrólisis de la fosfatidilcolina a lisofosfatidilcolina, el cual es una molécula con capacidad detergente y hemolítica. Por otro lado, los compuestos fenólicos son moléculas con un amplio espectro de actividades biológicas por lo que han sido utilizadas en la inhibición de PLA2 de diferentes especies. El estudio de la LDH proveniente de Vibrio parahaemolyticus se enfocó en obtención recombinante de la LDH, la inhibición de su actividad y la construcción de un modelo estructural por homología. La LDH se obtuvo como proteína recombinante en E. coli rosetta II y se purificó por IMAC en condiciones desnaturalizantes. Posteriormente, se replegó in vitro mediante diálisis en búfer Tris a pH 7.5. La actividad de la enzima a diferentes condiciones de pH, temperatura e inhibidores se determinó mediante la hidrólisis del PNFL en presencia de lecitina como activador. Adicionalmente se construyó un modelo estructural por homología con el programa MOE. Como resultados, se logró sobreexpresar y purificar a partir de cuerpos de inclusión la LDH en su forma activa. La LDH mostró una actividad de 0.47 U·mg-1(s), siendo la concentración del 0.001% (p/v) de lecitina en la que se observó una mayor actividad. La enzima presentó un pH óptimo de 8.0 y una temperatura óptima de 50 °C. Adicionalmente la LDH fue estable en un rango de pH de 6.5-11 y a la temperatura de 10-40 °C. Los valores cinéticos de Vmax y Km fueron de 0.80 U·mg-1(s) y 161.3 μM respectivamente. Los compuestos fenólicos fueron capaces de inhibir la actividad enzimática de la LDH, siendo la quercetina el mejor inhibidor con un IC50 =4.514μM. El modelo molecular por homología mostró una conformación del sitio activo adecuada para la catálisis, así como otros elementos estructurales característicos de la enzima. Estos resultados indican que los flavonoides son capaces de inhibir la actividad enzimática y hemolítica de la LDH de Vp.