Aislamiento y caracterización parcial de Proteasa(s) Aspártica(s) del hepatopáncreas de calamar gigante (Dosidicus gigas)

Abstract

Con el fin de evaluar la actividad proteolítica del hepatopáncreas del calamar gigante (Dosidicus gigas), se partió de organismos que mostraron una longitud total de entre 1.06 a 1.14 m y una longitud del manto de 63 a 68 cm, además de presentar un peso de entre 8 a I 0 kg ) de 0.306 ± 0.043 kg de hepatopáncreas, el cual representa el 3.3% del organismo total. El extracto crudo del hepatopáncreas del calamar (EC II C) mostró una actividad total de 2 1 2.5 U/ml a un pH de 3.5, así como de 236 mg de proteína. Después de haber evaluado el EC IJC se procedió a hacer dos pasos de purificación, el primer paso consistió en la precipitación fraccionada con sulfato de amonio, donde se obtuvieron 3 fracciones proteicas y se detectó que la actividad total esta concentrada en la fracción que precipitó del 30-70% de saturación. Además de lograr un grado de purificación de 1.6 X y un rendimiento del 87%. Con el objeto de conocer Ia actividad proteolítica contenida en la fracción 30-70%, se utiIizaron inhibidores especifícos para proteasas. siendo La pepstatina el inhibidor más efectivo, ya que se detectó un decremento del 66.7% de actividad, además, al analizar Ia actividad mediante un zimograma de electroforesis ácida la muestra que fue incubada con pepstatina no mostró actividad ya que se sabe que la pepstatina es un inhibidor especifico para las proteasas aspárticas. El segundo paso de purificación constó de Ia cromatografía de filtración en gel ( Bio ge l p-100 grueso). se obtuvo un pico d e mayor activid ad proteolítica en la fracción # 31, la cua l reveló una actividad de 1.43 U y al ser analizada por un zimograma ácido, previamente incubada con pepstatina, no se detectó act ividad en el gel. De la fracción # 31 se detectó una banda con peso d e 36.31 kDa la cual coincide con la catepsina D que se ha encontrado en otras especies de animales marinos. Después de haber evaluado la fracción # 3 1 se procedió a realizar una caracterización parcial de las fracciones # 27 hasta la 31 ( PII), en las cuales se detectó un pico d e máxima actividad a los 60°C, sin embargo se presentaron dos picos de máxima actividad a pH 4.5 y 5.5. Este comportamiento se puede atribuir a varios factores, tales como: la presencia de más de un tipo de enzimas proteolíticas con actividad aspártica, Ia presencia de isoformas, activas a diferentes pH y la temperatura a l a que se corrió el ensayo. Para corroborar esto es necesario purificar más a Ia enzima y evalua r la actividad variando no sólo el pH sino, también, la temperatura