Purificación y caracterización de una aminopeptidasa del hepatopáncreas de calamar gigante (Dosidicus gigas)

Abstract

Sonora es un gran productor nacional de calamar gigante (Oosidicus gigas) , aprovechándose la porción comestible (manto), el cual representa el 42% del peso total del organismo, mientras que los desechos de esta pesquería entre los cuales se incluye la glándula digestiva o hepatopáncreas (2. 3%), no reciben tratamiento alguno. El hepatopáncreas es una fuente de enzimas proteolíticas entre las que se encuentran las aminopeptidasas, las cuales pueden impartir atributos sensoriales de calidad a hidrolizados proteicos, alimentos fermentados y madurados. Por lo anterior, la purificación y caracterización de estas enzimas a partir de calamar gigante puede representar una alternativa viable para impartir valor agregado a la pesquería de esta especie. En este estudio se purificó una fracción aminopeptidasa a partir de atopáncreas de calamar gigante empleando cromatografía de intercambio iónico (DEAE-celulosa, pH 8.5, 0.2 M NaCI) y un gradiente de elusión de 0-0.35 M de NaCI; la fracción eluyó entre 0.25 y 0.3 M NaCI. La fracción aminopeptidasa obtenida contuvo una concentración de proteína de 0.14 mg/ml y una actividad aminopeptidasa específica de 0.0127 U/mg proteína, empleando como sustrato especifico L-leucina-p-NA. El rendimiento del proceso de purificación empleado fue del 0.84%. La actividad aminopeptídica se detectó en 7 substratos sintéticos, para los cuales la afinidad fue: L-prolina>L-metionina>Ac.L-y-glutamico>L-glicina>L-Leucina>L-alanina>L-Iisina-p-NA; Ia aminopeptidasa purificada presentó un peso molecular aproximado de 55 kDa, una Km de 0.3 mM y una Vmax de 2.54X10-6 seg-1; el pH óptimo de actividad con L-leucina-p-NA fue de 8 a 3rC y la temperatura de máxima actividad se encontró a 30°C con pH 7.2. La actividad dela fracción fue altamente estable a pH de 7 a 25°C y se inactivó a temperaturas superiores a 80°C a pH 7. La actividad L-Leucina aminopeptidasa de la fracción purificada fue activada por Zn+2 y Ca+2 e inactivada por Hg+2 , bestatin, EDTA y PCMB (38.46, 100, 50.12 y 36.29%, respectivamente). La fracción es capaz de hidrolizar caseína en solución, exhibiendo un grade de hidrólisis del 6%. Con base en los resultados obtenidos se concluyó que la fracción aminopeptidasa purificada del hepatopáncreas de calamar gigante es una metaloproteasa zinc-dependiente, con un grupo cistéico en su estructura que participa en la estabilidad de conformación del sitio activo. Aparentemente se trata de una leucina aminopeptidasa por sus características de inhibición ante bestatin. En base a la capacidad que esta fracción posee para hidrolizar caseína y permanecer estable a 70°C, puede proponerse su posible utilización en procesos de hidrólisis controlada en la industria de alimentos.