Recuperación intermedia de ADN plasmídico a partir de cultivos de E. coli aplicando ultrafiltración con flujo tangencial

Abstract

El interés en la terapia génica y en la producción de vacunas basadas en ADN plasmídico se ha incrementado en los últimos años, ya que son técnicas novedosas, para el tratamiento o para la prevención de enfermedades genéticas o infecciosas. El éxito de estas técnicas que utilizan ADN plasmídico como vector, depende del desarrollo de bioprocesos que entreguen este material de la mejor calidad y además sean escalables y sustentables. Actualmente existen estudios dirigidos por mejorar y optimizar cada una de las etapas involucradas en el proceso de purificación de ADN plasmídico. El bioproceso consta, en general de cuatro etapas: propagación celular, recuperación primaria, recuperación intermedia y purificación final. Esta investigación se centra en estudiar la etapa de recuperación intermedia, ya que es crucial para proveer un material de buena calidad en la etapa de purificación. La ultrafiltración con flujo tangencial (TFF) aparece como alternativa en la etapa de recuperación intermedia para la pre-purificación del plásmido a partir del lisado clarificado de cultivos de E.coli. Es una técnica de separación que se caracteriza por una circulación rápida del líquido a filtrar tangencialmente a una membrana. Dentro de sus ventajas se pueden mencionar el de concentrar y eliminar moléculas pequeñas y permeables (sales, proteínas, endotoxinas, ARN). Esto permite reducir la mayor cantidad de impurezas o contaminantes presentes en la solución conteniendo el plásmido. En el presente trabajo, se utilizó como macromolécula modelo el plásmido pVAX1 con el gen insertado LipL-32. La pre-purificación se logró con un sistema de ultrafiltración tangencial en modo continuo utilizando membranas huecas de diferente tamaño de corte: 100, 300 y 500 kDa. Seleccionando las condiciones de operación adecuadas incluyendo, tamaño de poro de la membrana, diferencial de presión y flujo de alimentación, se consiguió la remoción de contaminantes de la solución de lisado clarificado sin la necesidad de agregar agentes químicos al proceso. Además, se desarrolló un modelo, basado en el balance de masa, que describe el sistema de ultrafiltración tangencial que se utilizó en la etapa de recuperación intermedia. El sistema de ultrafiltración tangencial resultó ser eficiente para la pre-purificación de plásmido y se considera fácil de escalar sin generar un impacto ambiental desfavorable, dado que la operación no utiliza agentes químicos, ni produce desechos.